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2020年48卷5期

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分析化学 2020年第48卷第5期 封面及目次
2020, 48(5): 0-0.
[摘要](421) [FullText PDF](89)
摘要:
核酸适配体筛选与分析应用专辑
《核酸适配体筛选与分析应用》专辑序言
屈锋
2020, 48(5): 559-559.
[摘要](402) [FullText PDF](63)
摘要:
评述与进展
蛋白质的核酸适配体筛选及应用的研究进展
赵丽萍 , 杨歌 , 张小敏 , 屈锋
2020, 48(5): 560-572. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.201024
[摘要](550) [FullText PDF](124)
摘要:
核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)筛选方法获得的,能够与靶标分子高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA。蛋白质是一种非常重要的生物功能大分子,迄今为止,已经开发了许多SELEX技术,用于蛋白质的适配体的筛选。目前,适配体的筛选优化方法主要集中在提高筛选效率、降低筛选成本,以及提升适配体性能等方面,从而获得可与靶标分子以高亲和力和高特异性结合的适配体。适配体与靶标分子亲和力的表征是关键的筛选步骤,用于判定所筛选的适配体是否可以满足后续应用需求。本文归纳总结了2016年以来蛋白质靶标的适配体筛选的研究进展,对核酸适配体筛选过程中有关核酸库的优化方法和筛选方法的改进、新筛选方法的开发、核酸适配体的应用等方面的研究进行了评述。
小分子靶标的核酸适配体筛选研究进展
王子健 , 陈尔凝 , 杨歌 , 赵新颖 , 屈锋
2020, 48(5): 573-582. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.201101
[摘要](515) [FullText PDF](80)
摘要:
核酸适配体(Aptamer)作为新型识别分子,在小分子传感分析和检测中有很大的应用潜力。小分子的Aptamer筛选是其应用的前提。本文综述了2015~2019年,有关毒素、抗生素、激素等近80种小分子的Aptamer的筛选研究进展,归纳总结了近百条Aptamer序列和平衡解离常数KD及其测定方法,简要介绍了基于氧化石墨烯、人类基因组、石英晶体微天平以及计算机辅助筛选等改进型指数富集配体系统进化技术。
毛细管电泳与核酸适配体高效筛选
朱超 , 赵新颖 , 杨歌 , 屈锋
2020, 48(5): 583-589. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.201173
[摘要](399) [FullText PDF](44)
摘要:
指数富集配体系统进化(SELEX)技术是核酸适配体筛选的通用技术,精准高效的筛选方法和筛选策略设计是成功筛选适配体的关键。本文概述了本课题组自2007年以来,应用毛细管电泳(CE)技术研究核酸适配体高效筛选的有关工作,包括CE在核酸适配体筛选前、筛选中及筛选后各环节中的分析分离应用、不同蛋白靶的分类及筛选策略、多种CE筛选模式和多尺度靶标的核酸适配体筛选。同时,探讨了SELEX中存在的问题,并对其发展前景进行了展望。
基于微流控芯片的核酸适配体筛选技术研究进展
姜浩 , 吕雪飞 , 赵可心
2020, 48(5): 590-600,684. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191775
[摘要](397) [FullText PDF](65)
摘要:
适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的,可与靶标分子以高亲和力特异性结合的单链DNA或RNA,在生物分离分析、临床诊断和疾病靶向治疗等领域应用广泛。适配体的发展与筛选技术的进步密切相关,以SELEX为基础,研究者开发了磁珠SELEX和毛细管电泳SELEX等多种适配体体外筛选技术,但这些方法存在筛选轮次多、筛选周期长和样品消耗量大、对小分子筛选效率低等缺点。微流控芯片具有体积小、高通量和易集成等特点,基于微流控芯片的SELEX技术在一定程度上可解决上述问题,实现适配体快速、高通量的体外筛选。本文在总结SELEX及其关键技术要点的基础上,重点评述了基于微流控和微阵列芯片SELEX技术的研究进展,并对SELEX技术中未来的发展方向进行了总结和展望。
研究报告
毛细管电泳法筛选人IgG的Fc片段核酸适配体
杨歌 , 韩诗邈 , 赵丽萍 , 朱超 , 黄渊余 , 屈锋
2020, 48(5): 601-607. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191761
[摘要](479) [FullText PDF](30)
摘要:
基于毛细管电泳-指数富集配体系统进化技术(CE-SELEX)建立了免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段的核酸适配体筛选方法。通过毛细管区带电泳方法分析IgG完整蛋白、Fc与Fab片段的样品的纯度、荷电性质及是否吸附的特征,并比较三者与核酸库的亲和力。结果表明,IgG与核酸库形成明显的复合物,而Fc和Fab片段与核酸库的亲和力很弱。在筛选Fc片段的适配体时,选择Fab片段作为反筛靶,对去除非特异性结合序列无显著作用。设计了针对Fc片段的适配体筛选方案,在优化的孵育条件(10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4 (pH 7.17),0.05 mmol/L Mg2+,37℃孵育25 min)下,经3轮筛选获得Fc片段的核酸适配体Seq Fc1-3,KD值为0.071-0.321 μmol/L,经胶体金比色分析方法验证了其亲和力与特异性。
基于杂交链式反应的适配体传感器用于卡那霉素的比色检测
田润 , 陶晴 , 卞晓军 , 朱福琳 , 颜娟
2020, 48(5): 608-614. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191708
[摘要](435) [FullText PDF](59)
摘要:
基于醛基化磁珠颗粒(Aldehyde magnetic beads,AMBs)和DNA杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)的信号放大策略,设计了检测卡那霉素(Kanamycin,Kana)的比色适配体生物传感器(Aptasensor)。制备了Mbs@DNA复合物,其上的卡那霉素适配体链与卡那霉素发生特异识别后,释放出互补链,互补链含有设计好的引发序列,可作为信号探针,引发HCR反应,生成的双链DNA(Double-stranded DNA,dsDNA)表现出强负电性,与溶液中带负电金纳米颗粒(Goldnanoparticles,AuNPs)相互排斥,在高盐条件下,AuNPs的稳定性被破坏而发生聚集,导致溶液的颜色从红色变为紫色,吸收光谱也发生变化。本方法检测卡那霉素的线性范围为1.6~32.0 nmol/L,检出限为0.9 nmol/L(S/N=3);实际样品牛奶和蜂蜜样品中卡那霉素的加标回收率在96.0%~105.0%之间,相对标准偏差在3.3%~5.0%之间,说明本方法实用性良好。本方法对卡那霉素的检测具有较高的灵敏度和特异性,操作简单便捷,适用于现场检测等。同时,根据不同待测物具有与其特异性结合的适配体,本方法为其它目标物的检测提供了参考,在食品安全检测与监管中具有良好的应用前景。
毛细管电泳法研究核酸库容量对蛋白质适配体筛选的影响
李林森 , 朱超 , 赵毅 , 杨歌 , 屈锋
2020, 48(5): 615-622. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191693
[摘要](463) [FullText PDF](23)
摘要:
毛细管电泳(CE)具有高分辨、快速分离、样品用量小和无需固相介质等优点,是高效筛选核酸适配体的方法之一。然而,由于CE的进样量少,有限的核酸库容量是否影响毛细管电泳-指数富集配体系统进化(CE-SELEX)适配体的筛选效率,尚不明确。本研究以神经元特异性烯醇化酶(NSE)为模式蛋白,考察了CE筛选中核酸库容量对筛选效率的影响,以明确CE-SELEX方法的有效性。分别使用4个浓度(0.1、1、10和100 μmol/L)的初始核酸库进行适配体筛选,比较了初始库与经3轮筛选后的次级核酸库的亲和力。结果表明,4个核酸库筛选轮次间库亲和力相近,且经2轮筛选后均得到了微摩尔级别的核酸适配体。此外,用高浓度核酸库筛选获得的序列更具多样性,但未能提升候选序列亲和力。经2轮筛选得到NSE的核酸适配体Seq qN-01,其与NSE复合物的解离常数(KD)为(4.72±0.15) μmol/L,并表现出很好的特异性。综上,核酸库容量会提高后续富集库的序列多样性,但对适配体筛选效率没有显著影响。
哈维氏弧菌与溶藻弧菌共有核酸适配体的筛选及鉴定
刘慧敏 , 郝聚敏 , 许净 , 鄢庆枇 , 高晗 , 郑江
2020, 48(5): 623-631. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191663
[摘要](409) [FullText PDF](18)
摘要:
共有位点是指不同微生物上结构相同或相似的位点,有些共有位点是同种或同属微生物所共有的,可以作为微生物种属鉴定的标记位点。因此,筛选这些共有位点的共有核酸适配体,不仅有助于对这些微生物进行总量分析,对于相关微生物的种属鉴定也具有重要意义。本研究以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为靶目标,筛选这两种弧菌共有位点的共有核酸适配体。经过8轮筛选,适配体富集库的亲和力提高了24.1倍,同源性分析表明,适配体富集库呈明显的收敛性,表现了较好的筛选效率。对2个核酸适配体C14和C22的亲和性和特异性进行了研究,结果表明,这两个核酸适配体对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好的亲和性和特异性,但对哈维氏弧菌的亲和力要显著高于溶藻弧菌,而对非弧菌属的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的亲和力较弱。C14对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和常数(Kd)分别为55.76和82.88 nmol/L,C22对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和常数分别为33.97和43.95 nmol/L。二级结构分析显示,两个核酸适配体都以茎环结构为主,其中C22的3'端结构比C14更复杂。荧光显微镜下,与核酸适配体孵育的哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌(Escherichia coli)中,只有哈维氏弧菌和溶藻弧菌呈现出明显亮黄色的荧光,其它3种菌则无显著荧光,进一步证明了两个核酸适配体对这两种弧菌有较好的亲和性和特异性。本研究为这两种弧菌的识别检测及水产病原弧菌的种属鉴定奠定了基础。
毛细管电泳法筛选脱铁转铁蛋白的核酸适配体及筛选影响因素分析
杨歌 , 赵毅 , 韩诗邈 , 朱超 , 黄渊余 , 屈锋
2020, 48(5): 632-641. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191694
[摘要](364) [FullText PDF](22)
摘要:
核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,在体外筛选获得的与目标分子有高亲和力与特异性的寡核苷酸序列。由于筛选过程周期长且影响因素复杂,使用常规筛选方法进行多因素影响的条件优化的工作量大,样品消耗多,目前还少有系统的研究报道。毛细管电泳(CE)具有高分辨率、快速分离、样品用量小、筛选成本低的优势,是核酸适配体筛选的有效方法。本研究以人血清中脱铁转铁蛋白(A-TF)为模式蛋白,利用CE方法研究核酸库长度、孵育温度、缓冲溶液的种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸库相互作用的影响。结果表明,较短序列的核酸库与靶蛋白的亲和力更高;孵育温度、缓冲液种类与pH值均影响靶蛋白与核酸复合物的形成;低浓度的K、Ca2+与Mg2+可促进复合物形成。基于优化的筛选条件,经过3轮毛细管电泳法筛选,获得了A-TF的适配体Seq A3,采用CE-LIF测得复合物的亲和常数KD=0.476 μmol/L。此适配体可用于人血清基质中A-TF的识别。
乳腺癌生物标志物钙网蛋白的核酸适配体筛选及血清检测和乳腺癌细胞识别
孙淼 , 杨歌 , 赵毅 , 屈锋
2020, 48(5): 642-649. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.201004
[摘要](346) [FullText PDF](26)
摘要:
钙网蛋白(CRT)与许多癌症的发生密切相关,被认为是乳腺癌侵袭和转移的有效新型生物标志物以及乳腺癌分期和预后的评价指标。本研究利用毛细管电泳-指数富集配体进化技术(CE-SELEX)筛选并鉴定了CRT的核酸适配体。毛细管电泳法、等温滴定量热法及纳米金比色法表征结果表明,适配体Apt 23对CRT具有较高的亲和力和特异性。FAM标记的Apt 23(FAM-Apt 23)可用作毛细管电泳的亲和探针,采用激光诱导荧光检测器,检测血清中CRT的浓度范围为1~1000 nmol/L,检出限为0.5 nmol/L。FAM-Apt 23也可用作CRT的免疫荧光成像探针,可结合在CRT过表达的乳腺癌细胞4T1的表面。初步研究结果表明,利用毛细管电泳筛选的核酸适配体Apt 23可用于CRT识别和检测的探针。
特异性检测珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒病的核酸适配体的筛选与鉴定
余庆 , 刘明珠 , 肖贺贺 , 易弋 , 程昊 , Putra Dedi-Fazriansyah , 黎思巧 , 李鹏飞
2020, 48(5): 650-661. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191647
[摘要](403) [FullText PDF](15)
摘要:
石斑鱼虹彩病毒是一种核质DNA病毒,不仅给海水养殖造成巨大的经济损失,而且严重威胁全球生物多样性。为了进一步阐明石斑鱼虹彩病毒侵染致病的分子机理,同时为石斑鱼虹彩病毒病的预防、诊断和治疗提供新的理论依据,本研究以珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒(SGIV-Gx)感染的宿主细胞为靶标,采用指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选获得4条核酸适配体(LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4),并对核酸适配体的性质进行了系统的分析研究。各条核酸适配体识别SGIV-Gx病毒感染的宿主细胞具有高特异性和高亲和性,筛选的核酸适配体无毒副作用,而且核酸适配体LYGV3具有一定的抗病毒效果。对核酸适配体的靶标性质进行了分析,结果表明,核酸适配体(LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。其中,核酸适配体LYGV1的靶位点在SGIV-Gx病毒感染细胞2 h后出现在宿主细胞表面,核酸适配体LYGV2、LYGV3和LYGV4的靶位点的出现时间分别为病毒感染细胞后的4、8和6 h。
核酸适配体亲和柱净化-高效液相色谱法测定莲子中黄曲霉毒素B1
赵颖 , 王楠 , 高华龙 , 郭子轩 , 陆安祥 , 郭晓军 , 卢静华 , 栾云霞
2020, 48(5): 662-669. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.201030
[摘要](456) [FullText PDF](60)
摘要:
以特异性的核酸适配体作为识别元件,制备了黄曲霉毒素B1 (AFB1)的适配体亲和柱(AAC),用于AFB1的特异性识别和富集。对AAC的载样液中有机溶剂含量、载样液的体积和淋洗体积等条件进行了优化。此AAC吸附AFB1的柱容量达到(334.6±18.2) ng,且AAC可重复使用20次。莲子样品经AAC净化富集后,用高效液相色谱-光化学衍生荧光法检测,外标法定量,AFB1检出限达到0.05 ng/mL,回收率为91.8%~108.6%。本方法为食品、农产品和中药等复杂基质中痕量毒素的提取富集和分析提供了新的参考,具有良好的应用前景。
基于适配体的生物膜干涉检测重组人促红细胞生成素α新方法
贺小琴 , 罗黎 , 郭磊 , 谢剑炜
2020, 48(5): 670-675. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191676
[摘要](355) [FullText PDF](24)
摘要:
采用生物膜干涉(BLI)表面敏感光谱技术,建立了一种基于链DNA适配体39 nt的传感分析方法,实现了重组人促红细胞生成素α(EPO-α)的灵敏检测。将生物素化的39 nt固定于链霉亲和素传感芯片上,经2200 r/min高速振荡实现微升体积分析物的快速扩散。对适配体39 nt的取向、在BLI传感芯片上的固定浓度和非特异性吸附等影响因素进行了考察,发现50 nmol/L 3’末端生物素化39 nt具有最佳响应信号;加入Tween 20和牛血清白蛋白(BSA)可有效克服非特异吸附。基于麦胚凝集素构建了夹心法信号放大体系,在Tris-TB生理缓冲溶液中,检测EPO-α的线性范围为10~200 nmol/L,检出限为5 nmol/L。应用于人血浆等复杂基质中的EPO-α检测,回收率为86.7%~104.2%,RSD<11%,结果令人满意。此BLI传感体系为免标记蛋白相互作用和复杂生物样品检测等实际应用提供了有益参考。
纳米金-适配体比色传感法检测玉米油中黄曲霉毒素B1
杨妍 , 尹盈爱 , 董益阳
2020, 48(5): 676-684. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.191728
[摘要](438) [FullText PDF](61)
摘要:
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是真菌或霉菌产生的有毒代谢物,通过污染农作物和食品从而对人体健康造成严重威胁。本研究建立了纳米金(AuNPs)-适配体比色传感法,采用不同序列长度的AFB1适配体检测玉米油中AFB1。通过优化适配体浓度、NaCl浓度和体系反应温度,进一步提高体系检测灵敏度。在最佳条件下,50(B50)和80(A80)个碱基长度的适配体建立的AuNPs-适配体比色传感法的检出限分别为13.55和10.56 ng/mL,线性范围均为20~1000 ng/mL,且选择性良好。基于B50和A80适配体比色传感法检测玉米油中AFB1的加标回收率分别为102.4%~104.9%和98.1%~109.1%。结果表明,基于B50和A80建立的AuNPs比色传感法均可用于玉米油中AFB1特异性鉴定。本研究为现场快速检测和高效筛查食品中AFB1污染提供了技术支持,为开发针对其它靶标的适配体传感检测方法奠定了基础。