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环形离子淌度助力蛋白质研究

来源: 沃特世 阅读数:84 时间:2020-09-18 10:28:46

New directions in science are launched by new tools much more often than new concepts.

- Freeman Dyson, ‘Imagined Worlds’Harvard University Press


蛋白质研究方面,离子淌度质谱可以分离蛋白的寡聚态和共聚态构象、测量复合蛋白构象的CCS值、探索蛋白结构域的构象以及蛋白与配体间的稳定性等。但是对于蛋白质精细结构的分析,需要更高的离子淌度分辨率及多样的数据采集方式。 


环形离子淌度可以有效实现增长淌度分离器长度的目的,从而增加淌度分辨率。自诞生以来,以其优异的离子淌度分辨率灵活多样的数据采集模式,帮助了脂质组学、表观转录组学、糖组学、结构生物学、石油组学、药物代谢组学等不同领域的科学家实现了新的突破。


上两期小编带大家看了环形离子淌度在脂质组学、表观转录组学、天然产物的新拓展。这期,咱们来看看环形离子淌度是如何解决蛋白质分析瓶颈的。



在生物组织中直接分析完整蛋白质一直是一个难点。常规利用液质联用的方法耗时长,前端色谱分离通常需要数分钟到数小时的时间。LESA(液体萃取表面分析)技术可以在生物组织切片上直接萃取蛋白质,因此与质谱技术结合可以对完整蛋白质进行直接分析。


Emma K. Sisley等将LESA和环形离子淌度技术结合,对小鼠大脑和大鼠肾脏切片表面的蛋白质进行直接分析[1]。以大鼠肾脏样品为例(如下图),在没有环形离子淌度分离时,能鉴定出的蛋白质仅21个。在环形离子淌度仅做1圈分离时,能额外多鉴定出60个蛋白质,鉴定数量增加近3倍




在增加环形离子淌度的运行圈数后,从1圈逐渐增加至3圈,相应区域蛋白质的分离度逐渐增加,能看到的信息量逐步提高,所能鉴定出的蛋白质数量也逐渐增加(如下图)。







蛋白质离子在气象中构象稳定性可能会随着淌度分离时间的增长而变大。有实验表明,小蛋白的初始构象可能在几十毫秒内丢失[2]。Badman E R等人利用环形离子淌度质谱,观测不同分子量大小的蛋白质在淌度分离时的构象变化,结果发现几百毫秒后细胞色素C的结构变化依然很小,而更大的多聚体复合物刀豆球蛋白 A没有观察到任何变化[3]。这表明环形离子淌度分离本身所引起的蛋白离子结构扰动很小,有利于研究天然蛋白质的构象信息。




上图为不同蛋白在不同模式下构象变化对比图。环形离子淌度质谱可提供不同的离子淌度模式,用于研究时方法的灵活设置。Trapping模式用于研究蛋白质离子在trap池中的构象稳定性;Spinning模式用于研究蛋白质离子在淌度分离的过程中的构象稳定性;CIU模式可以实现多级淌度分离(IMSn),用于探索蛋白质离子去折叠的动态过程。


Dale A. Cooper-Shepherd等人利用CIU模式,实现对Human TTR四聚体的二级淌度分离(IMS2),揭示了该蛋白不同构象逐级去折叠的过程[4]




不同构象TTR 四聚体在CIU模式下去折叠



HDX-MS已经成为研究蛋白质构象的一个重要工具,然而分析过程中氘代的丢失可能导致实验的准确度降低,所以尽可能缩短分析时间,是HDX实验成功的关键因素之一。


目前肽图分析色谱分离时间通常需要几十分钟,不仅耗费时间,对于如HDX-MS的肽图分析,更是存在色谱分离过程中氘代丢失导致实验准确度降低的可能。而环形离子淌度由于加入了多维淌度分离,提高了峰容量,可以大大缩短色谱分离所需时间。有研究使用环形离子淌度进行了肽图实验,对比了3 min色谱分离时间和直接进样(infusion)肽图覆盖率的差异[5],结果显示3 min色谱分离的肽图覆盖率达到了82%,这与长梯度液相分离得到的结果相当。Infusion的实验只比3 min梯度测得的结果少检出一个肽段。



蓝色区域:LC-MS鉴定出肽段;红色下划线:infusion鉴定出肽段


另外,该研究还发现骨架上的氘代(即酰胺键上氢原子放生的氘代)不会随着环形离子淌度分离时间的增长而丢失(如下图),说明氘代在淌度分离过程中是相对稳定的。




环形离子淌度质谱可以将非靶向发现及靶向精细分析集成在一个平台上,其优异的离子淌度分辨率,及灵活多样的数据采集模式,将帮助科学工作者达到新的科学高度。



SELECT SERIES Cyclic IMS 环形离子淌度质谱


参考文献:

[1] Sisley E K, Ujma J, Palmer M, et al. LESA cyclic ion mobility mass spectrometry of intact proteins from thin tissue sections[J]. Analytical Chemistry, 2020, 92(9): 6321-6326.

[2] Badman E R, Myung S, Clemmer D E. Evidence for unfolding and refolding of gas-phase cytochrome c ions in a Paul trap[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2005, 16(9): 1493-1497.

[3] Eldrid C , Ujma J , Kalfas S , et al. Gas Phase Stability of Protein Ions in a Cyclic Ion Mobility Spectrometry Traveling Wave Device[J]. Analytical Chemistry, 2019, 91(12).

[4] Tandem ion mobility coupled with mass spectrometry for gas phase unfolding studies.Waters application notes.

[5] Application of cyclic ion mobility mass spectrometry for high peak capacity sepatations of native and deuterated peptide mixtures. Waters application notes.