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GC×GC TOF MS 3300全二维气相色谱-飞行时间质谱仪应用于人体尿液分析

来源:东西分析 阅读数:63 时间:2020-09-15 11:11:27

1 前言

人体排出代谢废物的主要途径之一是排尿,通过尿液检查可以判断相应的病征。遗传性代谢缺陷病是有机酸、氨基酸、糖、脂肪、激素等多种物质代谢缺陷的总称,虽然单一病种发病率低,但病种繁多,总体发病率较高。目前已认识的遗传代谢病已达500余种。利用气相色谱-飞行时间质谱联用仪(gaschromatography-time-of -flight mass spectrometry, 简称GC TOF MS)检测技术进行代谢性疾病的诊断,目前用此方法同时筛查氨基酸、有机酸、糖代谢异常及脂肪代谢紊乱等一百多种疾病。本文采用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪对人体尿液样品进行了分析,并与气相色谱-飞行时间质谱联用仪分析结果进行了比较,获得了更准确、更丰富的样品组分信息。


2 实验部分

2.1 主要设备与试剂

GC×GC TOF MS 3300全二维气相色-飞行时间谱质谱联用仪

分析天平涡旋混合器

离心机

氮吹仪

烘箱

冰箱

移液枪

PH 试纸

容量瓶

具塞玻璃试管

盐酸羟胺(优级纯)

盐酸(优级纯)

氯化钠(优级纯)

乙酸乙酯(色谱纯)


2.2 样品处理

采用干燥洁净的容器采集人体新鲜尿液,分装到离心管,冷藏保存。

取约 20mL人体尿样于50mL 塑料离心试管中,于冰箱中冷藏1h,然后放置于离心机中以4000r/min 离心10min,然后取上层澄清尿样2mL 于10mL 的玻璃具塞试管中,加入1mL 5%盐酸羟胺水溶液,涡旋混匀,室温下进行肟化反应1h; 肟化反应完成后加入浓盐酸调节PH 值为1,加入氯化钠使水层饱和(约1g),然后用6mL 乙酸乙酯涡旋提取两次,将两次的提取液合并于同一玻璃具塞试管中(共准确移取出5mL),然后于氮吹仪中60℃慢慢吹干,吹干后加入200uL 衍生化试剂(BSTFA+TMCS99:1),涡旋混合,然后放置于烘箱中于80℃衍生化反应30min,反应完成后将其转移至2mL 小样品瓶中,然后取1uL 进仪器分析。


2.3 分析条件

GC TOF MS分析条件:

一维色谱柱:DB-5MS(25m×0.25mm×0.25μm),

程序升温:70℃(保持5min)-6℃/min-220℃(保持3min)-10℃/min-325℃(保持5min);

进样口温度:260℃;

载气:高纯氦(纯度99.999%以上);

进样方式:不分流进样,开阀时间50s,阀开后分流30:1;

进样量:0.5μL;

流速:1.0mL/min,恒流;

溶剂延迟:4.5min。


GC×GC TOF MS 3300分析条件:

一维色谱柱:DB-5MS(25m×0.25mm×0.25μm),

程序升温:70℃(保持5min)-6℃/min-220℃(保持3min)-10℃/min-325℃(保持5min);

二维色谱柱:DB-17HT(3m×0.25mm×0.15μm);

程序升温:70℃(保持5min)-6℃/min-220℃(保持3min)-10℃/min-325℃(保持5min);

进样口温度:260℃;

载气:高纯氦(纯度99.999%以上);

进样方式:不分流进样,开阀时间50s,阀开后分流30:1;

进样量:0.5μL;  

流速:1.0mL/min,恒流;

溶剂延迟:4.5min。


调制器分析条件:

调制器恒定温度:280℃;

调制周期:10s,热吹0.4s。


TOF MS分析条件:

接口温度:250℃;

离子源温度:220℃;

离子化能量:-70eV;

检测电压:-1890V;

质量数采集范围:50-650;

采集速度:100谱/秒(全二维);

采集速度:1谱/秒(一维)。


3 实验结果

按上述方法条件对尿液样品进行前处理和气质联用仪分析图1和图2是GC TOF MS和GCxGC TOF MS分析尿液样品色谱图。从图1可以看出,一维气相色谱-飞行时间质谱联用仪色谱图共检出159种化合物,大部分色谱组分没有达到基线分离。图2可知,GCxGC TOF MS共检出535种化合物,所有组分基本可以达到完全分离。全二维气质的解析能力,让尿液样品复杂体系的完全分离成为了可能。


图1.一维GC TOF MS分析尿液样品总离子流图


图2.GCxGC TOF MS分析尿液2D总离子流图等高图


对GC×GC TOF MS检出的535个峰检索定性,NIST相似度大于70%,得到有机酸类、氨基酸类、糖类、醇类、酯类、酮类等6 类物质共204种成分。检测结果中,有机酸数量为107种,相对含量为52.45%,氨基酸类、糖类、醇类数量分别为22、22、23种,它们的相对含量基本相当,约为11%。图3为2D总离子流等高图,图4为3D总离子流图。


图3.GCxGC TOF MS分析尿液样品2D总离子流图等高图-定性(定性结果NIST相似度大于70%)


图4.GCxGC TOF MS分析尿液样品3D总离子流图


4 结论

本研究采用柱前衍生化全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensivetwo-dimensional gas chromatography-time-of -flight mass spectrometry,GC×GC TOF MS)技术对人体尿液进行检测,结果共检测出535个峰。同时,利用一维GC TOF MS对人体尿液进行分析,共检出159个峰。与一维GCTOF MS检出峰个数相比,GC×GC TOF MS多检出376个峰,大大的丰富了样品信息。对GC×GC TOF MS检出的峰检索定性,得到有机酸类、氨基酸类、糖类、醇类、酯类、酮类等6类物质共204种成分。检测结果中有机酸数量为107种,相对含量为52.45%,氨基酸类、糖类、醇类数量分别为22、22、23种,它们的相对含量基本相当,约为11%。本研究可为人体尿液代谢性疾病的诊断提供更为丰富、准确的信息。

分解结果表明采用GC×GC TOF MS 3300全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪检测衍生化处理后的尿液样品,可获得尿液中氨基酸、有机酸、糖代谢及脂肪代谢产物更详细的组分信息。与GC TOF MS气相色谱-飞行时间质谱联用仪相比,该方法更准确,峰容量更大,分离度更高,给出的样品信息更丰富。