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Science重磅 | Orbitrap超高分辨率质谱辅助揭开Z基因组生物合成通路的面纱

来源:赛默飞 阅读数:570 时间:2021-05-13 16:00:58
近日,天津大学张雁教授联合上海科技大学赵素文教授、美国伊利诺伊大学Huimin Zhao教授等研究团队,在生命科学领域取得突破性研究成果:解析了一种特殊DNA的合成机制,并发现了这种特殊DNA遍布全球,大量能感染细菌的病毒(这种病毒也称为噬菌体)都含有这种DNA。




这项重大发现对生命起源、物种进化、系统生物学的研究具有重要理论意义。该成果潜在应用价值广阔,包括超级耐药菌感染的治疗、绿色无抗生素畜牧饲料和食品保存技术开发、新型纳米材料制备、DNA信息存贮等。论文于4月30日在国际顶级学术期刊《科学》刊发。天津大学为本项研究成果的第一完成单位。

人类对于生命奥秘的探索从未停止,而基因作为生命的遗传物质自然而然地吸引了很多的研究者。1953年,Waston和Crick教授发现了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构,开启了分子生物学时代,使得人类对于生命的研究到了分子水平,解开了一个又一个生命的奥秘。二位教授也和Wilkins教授一起获得了1962年的诺贝尔生理学和医学奖,以表彰他们在DNA双螺旋结构研究中的突出贡献。

DNA有各种不同形式的修饰,其功能也不尽相同,但是通常情况下其碱基配对方式不会改变,即腺嘌呤(Adenine,A)和胸腺嘧啶(Thymine,T)配对,而鸟嘌呤(Guanine,G)与胞嘧啶(Cytosine,C)配对。

图源: https://www.amoebasisters.com/parameciumparlorcomics/dna-mnemonic

然而1977年前苏联科学家研究发现[1]蓝藻噬菌体S-2L为Z基因组生物(DNA中只含有Z、G、C、T),其遗传物质DNA中的腺嘌呤(A)完全被二氨基嘌呤(Diaminopurine,Z)取代,Z与T(胸腺嘧啶)碱基配对形成了三个氢键,从而改变了DNA的各种物理、化学性质,其碱基配对方式如下图所示。噬菌体Z基因组的生物通路研究具有重大理论意义。此外,Z碱基已在碳质陨石中被检测到,提示它可能是参与生命起源的核碱基[2]。


蓝藻噬菌体S-2L的基因组编码一个合成酶PurZ,PurZ为腺苷琥珀酸合成酶(PurA)的同源蛋白。在许多生物体中,PurA和PurB(腺苷琥珀酸裂解酶)通过两步酶促反应将单磷酸肌苷(Inosine monophosphate,IMP)转换为单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate, AMP),如下图所示,有研究表明PurZ参与了噬菌体Z-genome的生物合成[3]。 



为研究Z基因组的生物合成,上海科技大学的赵素文研究员、天津大学的张雁教授和美国UIUC的赵惠民教授课题组对参与Z基因组合成的复合酶进行了研究,并利用紫外-可见光谱和液相色谱-Orbitrap超高分辨率质谱联用技术对噬菌体PurZ的生物活性进行了检测分析。

首先,对噬蓝藻体S-2L(Cyanophage S-2L)的PurZ(CpPurZ)及与其同源性最高的菌株中华杆菌(Sinbacteraceae)噬菌体PurZ(SbPurZ)进行重组表达纯化,并将这两种PurZ复合酶的活性位点同Escherichia coli PurA复合酶(EcPurA)进行比较。

EcPurA的底物为IMP、三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate,GTP)和天冬氨酸(Aspartate,Asp),它可催化GTP的末端磷酸转移至IMP,然后用Asp取代这个磷酸,催化生成腺苷琥珀酸(Adenylsuccinate)[4],如下图所示:


在PurA复合酶的GDxxKG基序(其中x为任意氨基酸)中,其催化残基Asp13在PurZ中被Ser残基取代,这两个酶的分子模型如下图所示,由图可清晰地了解到,用体积较小的Ser取代Asp后,PurZ活性口袋就有足够的空间容纳底物(dGMP)中的2号位的氨基,PurZ的底物是脱氧磷酸鸟苷(dGMP),三磷酸腺苷(ATP)和天冬氨酸(Asp)。PurZ酶的催化机理如下图(可上下划动查看所有图片):





为了检测PurZ的催化活性,研究者将PurZ与过量的底物dGMP、ATP和Asp孵育,并检测不同时间点的吸收光谱,对碱基的反应程度进行监测。结果可见,随着时间的增加,紫外-可见光谱在287nm处有明显吸收,表明2-氨基脱氧腺苷琥珀酸(2-aminodeoxyadenylosuccinate)的生成。


为进一步确定PurZ催化反应的中间体及产物,研究者使用UltiMate3000 RSLCnano液相色谱-Q Exactive HF Orbitrap超高分辨质谱联用对反应样品进行了检测,结果显示,相比没有加SbPurZ的样品,加入SbPurZ进行反应后可多检测出两个质谱峰,同标准品进行比对,其精确质荷比表明这两个产物分别为二磷酸腺苷(Adenine 5′-diphosphate,ADP)和2-氨基脱氧腺苷琥珀酸(2-Aminodeoxyadenylosuccinate,ADAS),其中ADAS的碎片离子峰如下图(可左右划动查看所有图片)。


噬蓝藻体S-2L没有编码PurB裂解酶,宿主的PurB可能参与了将ADAS转化为dZMP,将SbPurZ的反应产物与EcPurB一起孵育,结果显示ADAS的质谱峰消失,同时出现一个质荷比为345.0718的质谱峰,其一级和二级质谱图如下(可左右划动查看所有图片),经鉴定得知此峰为dZMP,实验结果表明宿主细菌的PurB复合酶参与了dZMP的生成。





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