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动物源性食品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物残留量测定的前处理方法

来源:坛墨质检标准物质中心 阅读数:37 时间:2020-06-28 11:54:24

孔雀石绿的危害及检测目的

孔雀石绿又称碱性绿、苯胺绿,属于合成三苯甲烷类化工染料的一种,具有高效广谱的杀菌作用,被作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用,可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染,后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病。孔雀石绿在其进入人体后会代谢产生隐色孔雀石绿,从20世纪90年代开始,国内外学者陆续发现,孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿具有高毒、高残留、高致癌、高致畸、致突变等副作用。鉴于孔雀石绿的危害性,许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。2020年我国农业农村部公告第250号,也将孔雀石绿列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中。孔雀石绿是我国主要打击的滥用食品添加剂和违法添加非食用物质之一。

本文阐述了如何将孔雀石绿、结晶紫及其代谢物从样品基质中分离提取出来,并经过净化后,转化成液质联用仪或高效液相色谱仪可以检测的形式。以提取、净化为重点,依据国标GB/T 19857-2005,为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。

检测项目

孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫

应用范围

食品/水产品/鲜活水产品及其制品


液相色谱-串联质谱法

方法原理

试样中的残留物用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取,乙腈再次提取后,液液分配到二氯甲烷层,经中性氧化铝和阳离子固相萃取柱净化后用液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量。

前处理仪器

匀浆机;离心机(4000 r/min);超声波水浴;旋涡振荡器;KD浓缩瓶(25 mL);固相萃取装置;旋转蒸发仪。

检测仪器

HPLC-MS/MS+ESI源


前处理方法




提取


鲜活水产品

称取5.00 g已捣碎样品于50 mL离心管中,加入200 μL混合内标标准溶液,加入11 mL乙腈,超声波振荡提取2 min,8000 r/min匀浆提取30 s,4000 r/min离心5 min,上清液转移至25 mL比色管中;另取一50 mL离心管加入11 mL乙腈,洗涤匀浆刀头10 s,洗涤液移入前一离心管中,用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀,旋涡混匀器上振荡30 s,超声波振荡5 min,4000 r/min离心5 min,上清液合并至25 mL比色管中,用乙腈定容至25.0 mL,摇匀备用。


加工水产品

称取5.00 g已捣碎样品于100 mL离心管中,加入200 μL 混合内标标准溶液,依次加入1 mL盐酸羟胺、2 mL对-甲苯磺酸、2 mL乙酸铵缓冲溶液和40 mL乙腈,10000 r/min匀浆2 min,3000 r/min离心3 min,将上清液转移到250 mL分液漏斗中,用20 mL乙腈重复提取残渣一次,合并上清液。于分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷、35 mL水,振摇2 min,静置分层,收集下层有机层于150 mL梨形瓶中,再用20 mL二氯甲烷萃取一次,合并二氯甲烷层,45℃旋转蒸发近干。




净化


鲜活水产品

移取5.00 mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上,用KD浓缩瓶接收流出液,4 mL乙腈洗涤中性氧化铝柱,收集全部流出液,45 ℃旋转蒸发至约1 mL,残液用乙腈定容至1.00 mL,超声波振荡5 min,加入1.0 mL 5mmol/L乙酸铵,超声波振荡1 min,样液经0.22 μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。


加工水产品

将已活化的中性氧化铝柱串接在已活化的阳离子交换柱上方。用6 mL乙腈分三次(每次2 mL),涡旋溶解梨形瓶中提取物,并依次过柱,控制阳离子交换柱流速不超过0.6 mL/min,再用2 mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后,弃去中性氧化铝柱。依次用3 mL体积分数为2 %的甲酸溶液、3 mL乙腈淋洗阳离子交换柱,弃去流出液。用4 mL体积分数为5 %的乙酸铵甲醇溶液洗脱,洗脱流速为1 mL/min,用10 mL刻度试管收集洗脱液,用水定容至10.0 mL,样液经0.22 μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。

高效液相色谱法

方法原理

试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取,乙腈再次提取后,液液分配到二氯甲烷层并浓缩,经酸性氧化铝固相萃取柱净化后,高效液相色谱-二氧化铅柱后衍生测定,外标法定量。

前处理仪器

匀浆机;离心机(4000 r/min);固相萃取装置;25 %二氧化铅氧化柱:不锈钢预柱管 [5 cm×4 mm(内径)],两端附2 μm过滤板,抽真空下,填装含有25 %二氧化铅的硅藻土,添加数滴甲醇压实,旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将二氧化铅氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。

检测仪器

HPLC+UV-VIS


前处理方法




提取

称取5.00 g样品于50 mL离心管中,加入1.5 mL 20 %盐酸羟胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液,用匀浆机以10000 r/min的速度均质30 s,加入10 mL乙腈剧烈震摇30 s。加入5 g酸性氧化铝,再次震荡30 s。3000 r/min离心10 min。把上清液转移至装有10 mL水和2 mL二甘醇的100 mL离心管中。然后在50 mL离心管中加入10 mL乙腈,重复上述操作,合并乙腈层。




净化

在离心管中加入15 mL二氯甲烷,振荡10 s,3000 r/min离心10 min,将二氯甲烷层转移至100 mL梨形瓶中,再用5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重复上述操作一次,合并二氯甲烷层于100 mL梨形瓶中。45 ℃旋转蒸发至约1 mL,用2.5 mL乙腈溶解残渣。

将已活化的酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上,将梨形瓶中的溶液转移到柱上,再用乙腈洗涤瓶两次,每次2.5 mL,把洗涤液依次通过柱,控制流速不超过0.6 mL/min,收集全部流出液,45 ℃旋转蒸发至近干,残液准确用0.5 mL乙腈溶解,过0.45 μm滤膜,滤液供液相色谱测定。

注意事项
1

该国标方法分为两部分,第一部分是液相色谱-串联质谱检测法,又分为鲜活水产品提取净化方法和加工水产品提取净化方法;第二部分是高效液相色谱检测法,只有一种提取净化方法。

2

第一部分液相色谱-串联质谱法的检测限均为0.5 μg/kg;第二部分高效液相色谱法的检测限均为2.0 μg/kg。

3

在检测过程中,使用黑色Mark笔标记样品容器,非常容易导致结晶紫残留,污染样品。建议使用新的离心管、新的进样瓶等一次性提取容器;建议使用红色Mark笔替代黑色Mark笔进行标记。玻璃器皿如果重复使用,建议洗干净后用乙腈再洗涤一遍。

4

该国标方法中液质检测使用同位素内标法进行定量。分别为氘代孔雀石绿(MG-D5)和氘代隐色孔雀石绿(LMG-D6)。建议配合氘代结晶紫(CV-D6)和氘代隐色结晶紫(LCV-D6)一起使用。

5

该国标前处理过程比较复杂,涉及样品提取液部分净化,串接固相萃取柱净化,二次定容等步骤,注意稀释倍数,准确计算最终结果。

参考文献




GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定

鲜活水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量液质

测定的前处理流程图





加工水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量液质

测定的前处理流程图





水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量液相

测定的前处理流程图




孔雀石绿和结晶紫信息表

坛墨质检对应相关标物