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生物制药领域蛋白质团聚检测技术的研究进展
高恺旻 , 颜晓梅
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181280
21世纪是生物制药的黄金时代,以重组蛋白药物和治疗性抗体为代表的蛋白质药物已成为生物技术药物的重要组成部分,其对恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等重大疾病的治疗效果和生物安全性远高于小分子化学药物。但是蛋白质稳定性差,在生产、纯化、运输和储存等过程中,容易因环境刺激或自身稳定性等因素产生团聚,从而导致药效降低,并可能引发免疫反应。发展灵敏度高、分辨率好、简便实用的蛋白质团聚检测技术和方法,对蛋白质药物的研发和改良可起到积极的推动作用。本文针对蛋白质团聚的检测技术和方法进行综述,从检测原理、性能和应用范围等方面,对体积排阻色谱法、凝胶电泳法、分析超速离心法、场流分离法、浊度法、动态光散射法、纳米颗粒跟踪分析技术、流式细胞术和电子显微技术等进行分析比较,并对蛋白质团聚检测技术未来的发展趋势进行了展望。
关键词: 蛋白质药物, 蛋白质团聚, 尺寸分离, 光散射, 流式细胞术, 评述
高灵敏、宽动态范围纳米流式检测装置的研制及应用
毛翠萍 , 林垚 , 牛倩 , 薛乘风 , 颜晓梅
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201227
基于纳米颗粒固有的多分散性,对其粒径及分布快速地进行高分辨表征是纳米颗粒相关研究和产品开发所面临的重大挑战。与电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射、纳米颗粒追踪分析等常规使用的纳米颗粒表征技术相比,流式细胞术具有可单颗粒检测、快速、多参数、统计精确性高等优势。然而,由于检测灵敏度的局限性,商品化流式细胞仪难以检测粒径小于200 nm的聚苯乙烯纳米颗粒。结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术,本研究组研制了纳米流式检测装置(Nano-flow cytometer,nFCM),采用单光子计数雪崩光电二极管(Single photon counting avalanche photodiode,APD)作为检测器,低折射率二氧化硅纳米颗粒(SiO2 NPs)的检测下限可达到24 nm,可基线分辨47、59、74、94和123 nm的SiO2 NPs混合样本。由于nFCM散射光检测动态范围受限于单光子探测器的最大光子计数值,而纳米颗粒的散射光强度随粒径的增大呈指数上升,为实现纳米颗粒更全面的粒径分布检测,仪器的检测动态范围有待提升。本研究采用激光光束整形、双光阑降低背景信号、高量子效率光电倍增管检测器等策略对仪器进行多方位改进,以研制高灵敏、宽动态范围的nFCM。改进后的nFCM可实现直径59 nm SiO2 NPs的高信噪比检测(S/N=119),可基线分辨59、74、94、123、160、180和222 nm的SiO2 NPs混合样本,相比以APD为检测器的nFCM,粒径检测范围扩展约100 nm,并成功用于鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)粒径分布的快速测定。
关键词: 单颗粒检测, 光散射, 粒径分布, 纳米流式检测技术, 细菌外膜囊泡
尿液细胞外囊泡的单颗粒水平多参数定量表征
刘海生 , 袁文理 , 陈永钰 , 陈晨 , 田野 , 颜晓梅
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201443
尿液来源细胞外囊泡(Urinary extracellular vesicles,uEVs)作为新一类液体活检标志物,在疾病诊断、治疗监控领域具有广阔的应用前景。然而,由于缺乏相应的表征技术,研究者对于纳米尺度uEVs的粒径分布、颗粒浓度以及生化表型等均缺乏了解。EVs具有高度个体差异性和多样性,因此迫切需要发展高通量、多参数的单颗粒检测技术。基于本研究组前期工作中结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术研制的纳米流式检测装置(Nano-flow cytometer,nFCM),本研究对超速离心法纯化得到的uEVs的纯度、浓度、粒径、DNA、RNA和蛋白标志物在单颗粒水平进行多参数定量表征,其中EVs的检测限低至40 nm。结果表明,uEVs的纯度高达92%,10位健康受试者uEVs的颗粒浓度主要分布在3.0×109~8.9×1010个/mL之间,粒径主要分布在40~120 nm之间。DNA和RNA主要位于较大粒径的uEVs的内部,且颗粒之间的丰度存在很大的异质性。此外,使用nFCM对蛋白标志物CD9、CD63、CD81和CD24的阳性比率进行了测定。纳米流式检测技术可为uEVs的生化性质研究和临床应用提供重要的技术支撑。
关键词: 尿液细胞外囊泡, 纳米流式检测技术, 纯度, 粒径分布, 核酸, 蛋白标志物