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纳升液相色谱-高分辨串联质谱研究不同分离方法对唾液外泌体蛋白质组的影响
曾琼兰 , 吴利 , 李水明 , 王勇
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181261
外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(ExoQuick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌体蛋白质的效果。Brodford法和BCA定量测定结果表明,EQ方法分离0.5 mL唾液外泌体得到的蛋白质含量高于UC方法分离2 mL唾液所得到的蛋白质。进一步的质谱分析表明,前者鉴定到的蛋白质数目亦多于后者;试剂盒分离唾液外泌体与尿素缓冲液提取外泌体蛋白质的方法联用效果最佳,鉴定到194种蛋白质。本方法重现性好、样品用量少、检测结果稳定,可为在唾液外泌体中筛选疾病的标志物提供方法学参考。
关键词: 纳升液相色谱-高分辨串联质谱, 唾液外泌体, 外泌体试剂盒, 超高速离心法
基于不同沉淀方法检测小鼠心脏组织中S-棕榈酰化蛋白
程炜 , 占方玲 , 李水明 , 杨静波 , 王勇 , 刘宁
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.181619
酰基-生物素置换法(Acyl-biotinyl exchange,ABE)是利用生物素取代棕榈酸,进而对棕榈酸修饰的蛋白进行标记检测的方法,是检测S-棕榈酰化蛋白质的常用方法。本研究比较了ABE法中丙酮沉淀与甲醇-氯仿沉淀两种方法对S-棕榈酰化蛋白检测的影响,并对小鼠心脏组织中S-棕榈酰化修饰蛋白进行整体分析,进一步丰富S-棕榈酰化蛋白质的相关研究。首先用N-乙基马来酰亚胺(NEM)对小鼠心脏组织中蛋白质分子上的游离巯基进行封闭,再利用巯基反应性生物素化试剂(HPDP-Biotin)对羟胺(HA)切割后新产生的半胱氨酸巯基进行生物素标记,可检测出小鼠心脏组织中S-棕榈酰化修饰的蛋白。在此反应过程中,均通过蛋白沉淀法除去未反应的NEM、HA及HPDP-Biotin。基于不同沉淀方法对小鼠心脏组织总蛋白中的S-棕榈酰化蛋白进行标记后,利用链霉亲和素修饰琼脂糖珠对已标记上生物素的S-棕榈酰化蛋白进行富集,利用质谱检测分析。本研究共鉴定出50种S-棕榈酰化蛋白,其中丙酮沉淀实验组鉴定出23种S-棕榈酰化蛋白,甲醇-氯仿沉淀实验组鉴定出37种S-棕榈酰化蛋白,两组均鉴定出的蛋白有10种,不同的沉淀方法交叉互补使用可使鉴定结果更加丰富、可靠。
关键词: 心脏, S-棕榈酰化蛋白, 沉淀, 质谱
两种不同分离方法的唾液多肽组分析结果比较
孔祥怡 , 杜建时 , 徐金玲 , 李水明 , 王勇 , 赵晴
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191363
唾液多肽经Zip-Tip C18固相萃取和氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料(LaGM)两种方法分离后,利用高分辨串联飞行时间质谱进行多肽鉴定,将重复两次的结果合并,比较两种方法的异同。利用Zip-Tip C18方法共检测到归属于38种蛋白质的545条序列特异肽段,而LaGM方法检测到了来源于44种蛋白质的359条序列特异肽段,其中二者重合的有116条肽段,归属于21种蛋白质。两种方法所得的肽段分布特征和优势肽段构成存在明显差异,Zip-Tip C18更多富集Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B、Statherin和Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2等蛋白质的肽段,而利用LaGM方法可检测更多的来源于Histatin-1、Histatin-3和Protein S100-A8的肽段,考虑翻译后修饰,结论一致。以上结果表明,这两种方法对多肽的富集有一定偏好性,即多肽分离过程有可能导致肽段的特异性丢失。进一步分析发现,丢失肽段可能是检测到肽段的序列相关肽段、修饰相关肽段、所归属蛋白质的其它肽段或其它蛋白质的肽段,但序列相关肽段的几率更大。本研究表明,不宜用单一分离方法的结果代表整个多肽组,LaGM方法虽然检出肽段数目较少,但可以获取更多的降解蛋白质的信息。
关键词: 多肽组, Zip-Tip C18, 氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料, 唾液, 高分辨串联质谱
两种软件分析唾液多肽组结果的比较
万磊磊 , 陈琦 , 程思明 , 李水明 , 王勇
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201401
以10个唾液样本为例,唾液经氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料(LaGM)方法分离和高分辨串联飞行时间质谱进行多肽鉴定后,使用Peaks studio 8.5(PS)和Protein Pilot Software 4.0(PP)两种软件分别进行搜库分析后对比鉴定结果。研究发现,两种软件鉴定出的阈值以上肽段数量存在差异,PS软件通常能够鉴定出更多阈值以上肽段数目;两种软件鉴定出的阈值以上相同肽段在PS中占30%~60%,在PP中占60%~90%,即某些肽段只能被PS或PP一种软件所鉴定。但是,两种搜库结果在降解蛋白质数目上无明显规律,数目因样本而异。值得注意的是,如果以PP和PS的阳性结果相互参照,发现在一种软件中阈值以下的肽段,在另一种软件中也可能是在阈值以上,而且此概率与肽段的打分呈正相关。研究还发现,两种软件对不同长度肽段的鉴定有一定的偏好性:PS鉴定结果中短肽段较多,而PP软件可以给出更多的长肽段。比较而言,在PP中,短肽段易出现假阴性,在PS中,长肽段易出现假阴性,而信号的相对强度与阈值无明显的相关性。本研究结果表明,只使用一种软件进行分析,结果不能准确地代表多肽组的全部情况,两种软件都能提供另一软件鉴定不到的信息,将两种软件结果综合分析,能够得到更为全面的结果。
关键词: 多肽组, Peaks studio, Protein Pilot, 不确定性, 假阴性