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基于核酸外切酶Ⅲ信号放大的比率型荧光传感器检测致病菌基因
邓健康 , 牛晓娟 , 刘亚青 , 王硕
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181091
食源性致病菌严重威胁着公众健康。本研究基于荧光共振能量转移原理, 以Cy3和Cy5作为荧光供体和受体基团, 利用核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)增强检测信号, 构建了比率型荧光传感器, 用于高灵敏度检测致病菌基因。分别标记有Cy3的R1-DNA和标记Cy5的R2-DNA形成双链R1/R2, 在Cy3的激发光波长激发下, 由于发生荧光共振能量转移, Cy3的荧光被猝灭而产生Cy5的荧光信号。致病菌靶基因(大肠杆菌Lac Z基因)的存在可将R1/R2双链解旋, 使得Cy3远离Cy5, 导致Cy3的荧光恢复而Cy5的荧光信号降低。在Exo Ⅲ作用下, Cy3与Cy5的信号变化进一步增大。在优化的实验条件下, 荧光信号变化与靶基因在10~2000 pmol/L浓度范围内呈现良好的线性关系, 检出限为5.29 pmol/L。所采用的比率型信号检测策略极大地降低了假阴性、假阳性检测结果的产生, 增强了检测特异性。
关键词: 大肠杆菌, 致病菌基因, 荧光共振能量转移, 核酸外切酶Ⅲ, 比率型荧光生物传感器
Label-free定量蛋白质组学揭示GATA6调控胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的信号通路
刘文虎 , 袁江北 , 常晋霞
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191612
肿瘤细胞对曲妥珠单抗耐药是导致其化疗失败的主要原因。前期研究表明,在曲妥珠单抗耐药胃癌细胞(NCI N87/R)中,转录因子GATA6与DNA的结合活性显著增强,这与其耐药是否有关尚不清楚。本研究以NCI N87/R为研究对象,采用Crispr/Cas9技术构建GATA6敲除细胞系(NCI N87R/GATA6)。在此基础上,基于Label-free定量蛋白质组学技术并结合生物信息学分析GATA6调控曲妥珠单抗耐药的信号通路。蛋白样品经还原烷基化,FASP酶切,肽段经液相色谱分离,LC-MS/MS定量分析,通过差异倍数及t检验筛选差异表达蛋白;采用WebGestalt数据库进行基因本体分析,利用GeneAnalytics数据库进行通路富集分析。结果表明,敲除GATA6增强了曲妥珠单抗对NCI N87/R的抑制作用,降低其侵袭。采用质谱定量检测出5792种蛋白质,其中305种在NCI N87R/GATA6细胞中表达上调,182种表达下调。通路富集分析显示,线粒体转运、细胞凋亡、DNA损伤、葡萄糖代谢、丙酮酸代谢及TCA循环、Wnt/β-catenin降解通路在NCI N87R/GATA6细胞中显著改变。蛋白免疫印迹实验(Western blot)表明,线粒体动力蛋白OPA1和DNM1L、凋亡蛋白Caspase-9、TCA循环代谢酶SUCLG2和MDH1、糖原代谢酶PYGL在NCI N87R/GATA6中显著改变,表明GATA6敲除导致NCI N87/R细胞线粒体功能障碍、能量代谢异常,进而诱导其凋亡,提示抑制GATA6转录活性可能是逆转胃癌曲妥珠单抗耐药的有效途径。
关键词: 曲妥珠单抗, 抗药性, Label-free定量蛋白质组学, GATA结合蛋白-6, 信号通路
液相色谱-质谱联用-定向进化酶组合技术应用于三萜类皂苷转化研究
孙红梅 , 陆泽林 , 赵幻希 , 郑飞 , 李晶 , 刘明 , 越皓 , 于珊珊
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191501
利用定向进化技术重组糖苷酶ABQ,转化不同结构的三萜类皂苷(商陆皂苷甲、三七皂苷R1和柴胡皂苷A),通过高分离度液相色谱-四极杆飞行时间质谱鉴定转化的产物结构,阐明其转化机制。结果表明,重组糖苷酶ABQ能够催化商陆皂苷甲、三七皂苷R1和柴胡皂苷A侧链糖苷键的水解,转化为商陆皂苷乙、三七皂苷R2、柴胡次皂苷F和柴胡皂苷元F。根据色谱-质谱对反应产物的实时分析,ABQ对这3种三萜皂苷表现出不同的底物选择性,重组糖苷酶ABQ能够催化商陆皂苷甲C-3位外侧的葡萄糖水解,生成商陆皂苷乙;三七皂苷R1的C-20位葡萄糖被水解,生成三七皂苷R2;重组糖苷酶ABQ能够首先催化柴胡皂苷A的C-3位葡萄糖水解,生成柴胡次皂苷F,并继续催化C-3位的岩藻糖苷水解,生成柴胡皂苷元F。定向进化技术重组酶能够提高酶活力和作用环境适应能力,色谱-质谱联用通过原型和产物实时检测评价重组酶的作用。
关键词: 三萜皂苷, 生物转化, 液相色谱-质谱联用, 酶定向进化技术
利用非共价复合物实现对布洛芬分子的手性分析
古连城 , 周爱南 , 陈新 , 吴芳玲 , 李建其 , 余绍宁 , 周鸣飞 , 丁传凡
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201477
手性药物的检测对于深入了解药物作用机理具有十分重要的意义。布洛芬(Ibuprofen)是常用的临床消炎药物,具有R型和S型两种构型,但其消炎作用却几乎全部由S-布洛芬所提供。本研究建立了一种区分布洛芬手性的方法,将布洛芬对映体与γ-环糊精及BaCl2混合,得到系列非共价复合物,利用捕集离子淌度质谱(Trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight mass spectrometry,TIMS-TOF MS)测量各物质的离子淌度(Ion moboility)。采用TIMS-TOF MS成功分离了非对映体离子[γ-CD+R-Ibuprofen+Ba(BaCl)-H]2+与[γ-CD+S-Ibuprofen+Ba(BaCl)-H]2+,碰撞截面的差值高达0.07 nm2。此外,实验结果表明,一系列[γ-CD+S-Ibuprofen+Ba(BaCl)-H]2+的离子淌度谱峰强度分数与其摩尔分数呈线性关系。本方法无需对样品分子进行前处理或化学衍生化,可以快速、高效地分析手性分子。
关键词: 布洛芬, γ-环糊精, 氯化钡, 非共价复合物, 手性分析, 捕集离子淌度质谱
基于碳纳米点荧光增强检测铝离子
康倩文 , 张国 , 柴瑞涛 , 朱维晃 , 冯建军 , 陈利君
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191538
以抗坏血酸(AA)为碳源,通过一步水热法合成水溶性绿色荧光碳纳米点(Carbon nanodots,CDs)。采用透射电子显微镜(TEM)、X射线光电子能谱(XPS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对其形貌和性质进行了研究。基于此碳纳米点与Al3+结合产生的荧光增强现象,建立了检测Al3+的荧光分析方法,在50~500 nmol/L (R2=0.9988)和500~2000 nmol/L (R2=0.9976)范围内呈良好的线性关系,检出限为10.23 nmol/L (S/N=3),并用于对瓶装饮用水样品中Al3+的检测。
关键词: 碳纳米点, 抗坏血酸, 荧光增强, 铝离子, 检测
钯-氧化锌纳米管修饰电极同时检测多巴胺、抗坏血酸和尿酸
唐倩 , 陈梦妮 , 朱国栋 , 刘建允
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201241
以PdCl2和Zn(Ac)2为起始物,采用静电纺丝方法结合高温煅烧,成功制备了钯-氧化锌(Pd-ZnO)中空纳米管。Pd的存在改善了ZnO晶体颗粒的均匀性,调控纤维向中空管状结构转变。利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、X射线衍射等表征技术证明了纳米管内径为240 nm,Pd纳米粒子粒径约为80 nm,且在纳米管上均匀分布。X射线光电子能谱证明,Pd纳米粒子主要以PdO形态存在。所得的Pd-ZnO修饰玻碳电极对多巴胺(DA)、抗坏血酸(AA)和尿酸(UA)均显示出良好的催化活性。采用差分脉冲伏安法测定含DA、AA和UA的混合液,三者的氧化峰电位在此修饰电极上可完全分离,对应的线性范围分别为3.0×10-7-3.0×10-5 mol/L(R2=0.9967)、1.0×10-5-1.0×10-3 mol/L(R2=0.9991)和6.0×10-6-6.0×10-4 mol/L(R2=0.9935),检出限(S/N=3)分别为1.0×10-8 mol/L、1.0×10-6 mol/L和3.0×10-6 mol/L。此电极重现性及稳定性良好,可同时测定样品中的DA、AA和UA。
关键词: 多巴胺, 抗坏血酸, 尿酸, , 氧化锌, 脉冲伏安法
分子印迹聚合物固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中11种氨基糖苷类药物残留
黄原飞 , 娄晓祎 , 周哲 , 汪洋 , 孔聪 , 黄冬梅 , 蔡友琼 , 于慧娟
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.171175
建立了水产品中巴龙霉素、壮观霉素、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素B、安普霉素、链霉素、双氢链霉素、丁胺卡那霉素和新霉素共11种氨基糖苷类药物(AGs)残留的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。样品经磷酸盐缓冲液提取,分子印迹聚合物(MIP)固相萃取柱净化,Obelisc R色谱柱分离,采用超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定。方法检出限(LOD,S/N≥3)为1.0~10.0 μg/kg,定量限(LOQ,S/N≥10)为2.0~20.0 μg/kg。11种AGs在1.0~1000 μg/kg范围内线性关系良好(R2>0.994),在水产品中加标回收率为78.4%~109.6%,相对标准偏差(RSD,n=6)为2.3%~14.9%。本方法灵敏度高,且可实现11种AGs同时检测。
关键词: 分子印迹聚合物固相萃取, 超高效液相色谱-串联质谱, 水产品, 氨基糖苷类
基于氧化石墨烯-纳米镍修饰电极的化学耗氧量即时检测系统
冯艳 , 王济奎 , 张宝剑 , 孙倩雯 , 李晓璐 , 张之翼 , 唐美华 , 陈国松
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181031
建立了一套流动态下即时测定化学耗氧量(COD)的电化学分析系统。以GO-NiNPs修饰的平面电极与3D打印薄层流通池构成检测模块,微型蠕动泵驱动试液流经电极表面,采用计时电流法进行测定。考察了修饰材料、介质和电化学操作条件对电极表面形态及分析性能的影响。此装置对COD的响应时间为1.5 min,样品用量约2 mL。在低浓度区间的线性响应范围为0.15~100 mg/L,线性方程i(μA)=3.974c(mg/L)+0.2295,相关系数R=0.9991,检出限0.04 mg/L;在高浓度区间的线性响应范围为100~450 mg/L,线性方程i(μA)=1.938c(mg/L)+230.9,相关系数R=0.9877。此系统对典型环境水样的测定结果与国标GB11914-89法测定结果间相关性良好,而耗时仅为其1/100,且无需使用任何贵重及毒害性试剂,避免了二次污染,具有良好的便携性。
关键词: 氧化石墨烯, 纳米镍, 平面电极, 3D打印薄层流通池, 化学耗氧量, 即时检测
二氧化钛纳米管阵列/钛pH电极制备与表征
李振 , 刘寒蒙 , 姚志霞 , 孙玉静 , 李壮
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181459
采用阳极氧化法,在含有NH4F以及乙二醇和水的混合溶液中,阳极氧化金属钛丝,制备二氧化钛纳米管阵列/钛(TiO2 NTAs/Ti)作为pH电极。利用扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)和X射线光电子能谱(XPS)对电极进行了表征。考察了电极的亲水性以及表面化学吸附氧OH)(性能,探究了pH响应机理。当控制电解电压为30 V、电解液为含有NH4F (0.5%,w/w)以及乙二醇和水(9:1,V/V)的混合溶液、阳极氧化时间为10 min时,制备的TiO2 NTAs/Ti电极在B-R缓冲溶液(pH=3~11)中具有最佳pH响应,灵敏度为(-55.17 ±0.28) mV/pH,相关系数(R2)>0.9966。常见离子对电极的影响可以忽略不计。制备的pH电极具有良好的稳定性,并成功用于维生素饮料和海水pH值的测定。
关键词: 二氧化钛, 纳米管, pH电极, 阳极氧化, 金属氧化物
基于纳米孔单分子技术的抗结核药物异烟肼的检测新方法
成丹 , 郭艳丽 , 亢晓峰
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181296
基于纳米孔单分子检测技术,利用α溶血素突变蛋白(M113R)7和6-氨基-6-脱氧-β-环糊精(am7βCD)适配体构建了一种新型传感器((M113R)7-am7βCD),建立了快速、高灵敏度的抗结核药物异烟肼(Isoniazid,INH)的单分子检测新方法。优化了通道蛋白、缓冲液pH值、电压等条件。相比于野生型蛋白和(M113N)7突变蛋白,(M113R)7突变蛋白更利于检测;在中性缓冲溶液和高电压条件下,从cis端加入异烟肼,可获得更高的检测灵敏度。在高于异烟肼浓度40倍的条件下,此传感器对一些常见药物赋形剂(葡萄糖、蔗糖、淀粉)、溶液中可能共存的金属离子以及异烟肼的合成中间体异烟酸均无响应,表明其对异烟肼有良好的选择性。在最佳测试条件下,异烟肼浓度在0.5~30 μmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为2 nmol/L。本方法直接应用于药片中异烟肼含量的测定,加标回收率为92.9%~108.2%。
关键词: α溶血素纳米孔, 单分子检测, 环糊精适配体, 异烟肼
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